微生物菌種資源的長(zhǎng)期有效保藏是微生物菌種資源有效實(shí)施共享的前提，采用操作性簡(jiǎn)便、保藏周期長(zhǎng)、遺傳變異率低是菌種資源保藏方法的選擇。液氮罐

1、范圍

本規(guī)程規(guī)定了冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術(shù)的定義、原理、技術(shù)要求、方法與步驟。

本規(guī)程適用于普通病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及擔(dān)子菌等微生物菌種的保藏。

對(duì)于病原微生物及其他需要特殊操作技術(shù)的微生物的參見相應(yīng)的技術(shù)規(guī)程。

2、規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本規(guī)范的引用而成為本規(guī)范的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本規(guī)范，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本規(guī)范達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本規(guī)范。

國(guó)務(wù)院令第 424 號(hào)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》

GB 19489  實(shí)驗(yàn)室  生物安全通用要求

科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件  自然科技資源共性描述規(guī)范（試行）

3、術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)范。

3.1

冷凍干燥  freeze-drying

將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止，從而長(zhǎng)期維持存活狀態(tài)。

3.2液氮超低溫保藏  preservation  in  liquid  nitrogen

液氮超低溫保藏技術(shù)是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮，或在-150℃的氮?dú)庵械拈L(zhǎng)期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。

3.3   -80℃低溫冷凍保藏  preservation  in  -80℃

將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行冷凍的一種保藏方法。

4、內(nèi)容

4.1   微生物菌種的冷凍干燥保藏技術(shù)規(guī)程

4.1.1   好氧菌冷凍干燥管的制備

4.1.1.1   安瓿管準(zhǔn)備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí)，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來(lái)水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

4.1.1.2   保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備

保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

4.1.1.3    凍干樣品的準(zhǔn)備

在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后（參見《微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》），與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長(zhǎng)的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短，最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。

4.1.1.4    預(yù)凍

一般預(yù)凍2小時(shí)以上，溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。

4.1.1.5   冷凍干燥

采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。

將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時(shí)間一般為8-20小時(shí)。

終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：

——安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀

——真空度接近空載時(shí)的最高值

——樣品溫度與管外溫度接近

——選用1-2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)

——選用一個(gè)安瓿管，裝1-2%氯化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)

冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。

4.1.1.6   真空封口及真空檢驗(yàn)

將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。

熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測(cè)定儀測(cè)定真空度。

4.1.1.7   保藏

安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。

4.1.1.8   質(zhì)量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。

4.1.2    厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同

4.1.2.1   安瓿管準(zhǔn)備

參見4.1.1.1

4.1.2.2   保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備

保護(hù)劑使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護(hù)劑中的溶解氧 液氮罐

4.1.2.3    凍干樣品的準(zhǔn)備

參見4.1.1.3

4.1.2.4   預(yù)凍

參見4.1.1.4

4.1.2.5冷凍干燥

參見4.1.1.5

4.1.2.6    真空封口及真空檢驗(yàn)

參見4.1.1.6

4.1.2.7   保藏

參見4.1.1.7

4.1.2.8    質(zhì)量檢查

參見4.1.1.8

4.1.3    冷凍干燥法適用范圍

適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。

4.1.4    保藏周期

不同微生物復(fù)蘇周期不同，一般10年左右。

4.1.5   復(fù)蘇方法

——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，

——將安瓿管頂部燒熱，

——用無(wú)菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，

——用無(wú)菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無(wú)菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)行適溫培養(yǎng)。

4.2     微生物菌種低溫冷凍保藏技術(shù)

4.2.1  液氮超低溫保藏技術(shù)

4.2.1.1   安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備

用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈，  121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

4.2.1.2   保護(hù)劑的準(zhǔn)備

保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度，一般采用10-20% 甘油。

4.2.1.3    微生物保藏物的準(zhǔn)備

微生物不同的生理狀態(tài)對(duì)存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。

分裝時(shí)注意應(yīng)在無(wú)菌條件下操作。

菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法：

刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；

接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi)；

將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無(wú)菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；

在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護(hù)劑，待保藏。

4.2.1.4      預(yù)凍

預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結(jié)到-35℃。

目前常用的有三種控溫方法：

——程序控溫降溫法，應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率。

——分段降溫法：將菌體在不同溫級(jí)的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時(shí)，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。

——對(duì)耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。

4.2.1.5   保藏
 
將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。液氮罐

4.2.1.6保藏周期

一般10年以上。

4.2.1.7   復(fù)蘇方法

從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置在38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

4.2.1.8   適用范圍

各類微生物。

4.2.1.9   液氮保藏應(yīng)注意事項(xiàng)

——防止凍傷，操作注意安全，帶面罩及皮手套

——塑料凍存管一定要擰緊螺帽

——運(yùn)送液氮時(shí)一定要用專用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運(yùn)輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮

——注意存放液氮容器的室內(nèi)通風(fēng)，防止過量氮?dú)馐谷酥舷?br />
——防止安瓿管或塑料凍存管破裂爆炸，如液氮滲入管內(nèi)，當(dāng)從液氮容器取出時(shí)，液態(tài)氮體積膨脹約680倍，爆炸力很大，要特別小心

——注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期補(bǔ)充液氮。

4.2.2    -80℃低溫冷凍保藏

4.2.2.1  安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備

參見4.2.1.1

4.2.2.2   保護(hù)劑的準(zhǔn)備

參見4.2.1.2

4.2.2.3   微生物保藏物的準(zhǔn)備

參見4.2.1.3

4.2.2.4    凍結(jié)保藏

將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。

4.2.2.5   保藏周期

一般1-5年。

4.2.2.6    復(fù)蘇方法

從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)快速搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

4.2.2.7   適用范圍

各類微生物。